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家兔角膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法

采用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行家兔角膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)。
選擇重1. 5～2. 0 kg 的新西蘭白色健康家兔,用空氣栓塞處死后迅速取下眼球,用1/ 5000 氧氰化汞和生理鹽水沖洗眼球。在超凈工作臺上無菌操作,沿角膜緣取下角膜,在解剖顯微鏡下完整剝離角膜內(nèi)皮,用剪刀剪取剩余的組織至2 mm 大小塊,接種到培養(yǎng)瓶中,基質(zhì)面朝下,上皮面朝上,放入37 ℃、5 % CO2 培養(yǎng)箱中干涸2 h后,加入適量培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),每周更換培養(yǎng)液2次,待細(xì)胞匯成片后用消化液消化傳代。培養(yǎng)液成分為RPMI-1640 培養(yǎng)液,內(nèi)含10 %新生牛血清、青霉素100 U/ ml 、鏈霉素100μg/ ml ,pH 值7. 2～7. 4 ,消化液為0. 2 %胰蛋白酶和0. 02 % EDTA 的等體積混合液。
每天用倒置顯微鏡觀察,角膜組織接種24 h 后即有角膜上皮細(xì)胞自組織塊邊緣移行并增生,1 w 后細(xì)胞生長分裂旺盛,細(xì)胞變成不規(guī)則的多邊形,約2 w 后細(xì)胞匯合成單細(xì)胞片