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用熒光顯微鏡細胞內(nèi)自由鈣離子濃度測量
要用一個線粒體特異性的探針或者線粒體特異性定位的蛋白做免疫熒光以標(biāo)記線粒體的位置，再以一種不同顏色的二抗標(biāo)記目的蛋白，最后觀察兩種熒光的疊加情況。如果需要更精確的可以分離線粒體后用western blot檢測。如果想用形態(tài)學(xué)方法建議共聚焦或者免疫電鏡，選一種吧，但是看過很多線粒體的文章，用共聚焦的更多，不過需要根據(jù)的實際情況吧，免疫電鏡也是認可的。
Ca2+作為細胞內(nèi)的第二信使，調(diào)控著許多重要的生理活動。從六十年代開始，一些研究小組就已經(jīng)開始合成各種熒光劑進行定量檢測Ca2+濃度，目前常用的熒光劑有第二代的fura-2, indo-1, rhod-2以及第三代的Fluo-3, Fluo-4, Fluo-5系列、Calcium Green等。
計算細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的公式根據(jù)不同熒光劑分兩種情況。
第工一種是單激發(fā)熒光劑（如Fluo-3）
[Ca2+]=Kd[F-Fmin]/[Fmax-F]
其中，Kd為熒光劑與Ca2+形成配合物的解離常數(shù)。Fmin是熒光劑沒有結(jié)合Ca2+時熒光最小值；Fmax是熒光劑被Ca2+飽和時的熒光最大值。
第二種是雙激發(fā)熒光劑（如fura-2）
[Ca2+]=Kd[R-Rmin]/[Rmax-R]
其中R=F1/F2, F1為激發(fā)波長1的熒光強度，F(xiàn)2為激發(fā)波長2的熒光強度。Rmin是Ca2+濃度為零時，熒光最小比值，Rmax為飽和濃度的熒光最大比值。
熒光強度測量方法可以用熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡和近幾年興起的雙光子熒光顯微鏡。熒光顯微鏡一般采用氙燈、汞燈等光源；共聚焦顯微鏡采用激光為激發(fā)光源，優(yōu)點是得到很高的分辨率，記錄鈣離子三維空間分布；雙光子熒光顯微鏡則采用紅外激光作為光源，具有很高空間分辨率，而且背景噪聲比較低。
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