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對(duì)樣品不同光學(xué)焦面圖像三維重構(gòu),獲得整體三維圖像 光鏡技術(shù)的第四階段是發(fā)明了一些更精密的、具有更多新功能的新一代顯微鏡，其中最重要的是共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope)。它在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上全面更新，利用激光作為點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在光學(xué)焦面上形成微米級(jí)的光點(diǎn)。所激發(fā)的熒光通過物鏡與分光器后，送到探測(cè)器。光源和探測(cè)器前方各有一個(gè)針孔，光點(diǎn)通過一系列透鏡同時(shí)聚焦到這兩個(gè)針孔，這便是“共聚焦”的含義。這樣，來自光學(xué)焦面的光可以匯聚在針孔范圍之內(nèi)，而其他散射光一概被排除在針孔之外。以激光逐點(diǎn)掃描樣品，探測(cè)器也逐點(diǎn)捕獲對(duì)應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，并轉(zhuǎn)為數(shù)字傳至計(jì)算機(jī)。通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行圖像處理后，最終在屏幕上顯示整個(gè)焦面的圖像。如果需要，還可以對(duì)樣品不同光學(xué)焦面的圖像進(jìn)行三維重構(gòu)，以獲得整體三維圖像?！ ≡嫉娘@微照相機(jī)其實(shí)比一般照相機(jī)簡(jiǎn)單，它不需要鏡頭等光學(xué)部件，因?yàn)轱@微鏡已經(jīng)具備了光學(xué)系統(tǒng)。它只需要一個(gè)照相機(jī)底座，安裝在顯微鏡的鏡筒上，對(duì)焦后手動(dòng)按下快門即可攝取圖像。后來又發(fā)明了自動(dòng)控制曝光系統(tǒng)，能依據(jù)樣品影像的明暗、顏色等參數(shù)，精確地計(jì)算出曝光時(shí)間。這樣不僅能拍攝黑白照片，還能拍攝彩色照片；不僅能拍攝明視野圖像，還能拍攝暗視野、干涉差、熒光等圖像；不僅能拍攝負(fù)片，還能攝制用于幻燈播放的反轉(zhuǎn)片。再后來，隨著數(shù)字技術(shù)的問世，數(shù)碼相機(jī)逐漸流行，顯微攝影也以CCD+相機(jī)取代了傳統(tǒng)的膠卷式相機(jī)，其優(yōu)點(diǎn)正如一般數(shù)碼相機(jī)，就不必贅言了。為了減少光電傳輸中的噪音，在高級(jí)顯微鏡上還設(shè)置了在低溫條件下工作的冷卻式CCD(cooled CCD)，特別適用于攝取高清晰度的熒光顯微圖像。
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